복합 배지에서 세포외 소포의 표면 마커 특이적 분리를 위한 병렬 면역자기 나노기공 분류의 모델링 및 최적화

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 13292(2023) 이 기사 인용

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표면 마커의 발현을 기반으로 세포외소포(EV)의 특정 하위 집단을 분리하는 것은 나노 크기(< 800nm), 이질적인 표면 마커 발현 및 임상 표본에 존재하는 수많은 배경 EV로 인해 중요한 과제를 제기합니다. (혈액 내 1010-1012 EVs/mL). TENPO(트랙 식각 자기 나노기공) 칩을 사용한 고도로 병렬화된 나노자기 정렬은 높은 처리량과 막힘에 대한 탄력성을 갖춘 정밀한 면역특이적 정렬을 달성했습니다. 그러나 이 접근 방식에서 처리량, 목표 EV 복구 및 배경 EV 폐기 기능의 균형을 제어하는 설계 매개변수에 대한 체계적인 연구는 아직 이루어지지 않았습니다. 우리는 TENPO 칩의 유한 요소 시뮬레이션과 실험적 특성화를 결합하여 혈액에서 EV 하위 집단을 분리하기 위한 설계 규칙을 설명합니다. 우리는 기공 직경, 직렬로 배치된 멤브레인 수 및 유속을 선택하여 대상 EV의 복구를 희생하지 않고 이전에 발표된 설계에 비해 장치 배경을 10배 이상 줄임으로써 이 접근 방식의 유용성을 입증합니다. 우리는 TENPO 분리 EV를 표준 EV 분리 방법과 비교하고 폐암, 췌장암 및 간암을 포함한 여러 질병 모델의 EV 하위 모집단을 표적으로 삼아 광범위한 적용 및 모듈성에 대한 유용성을 입증합니다.

세포외 소포(EV)는 핵산 화물을 포함하고 기원 세포를 반영하는 표면 단백질을 발현하는 나노 규모(< 800nm)의 막 입자입니다1. 여러 화물을 운반하고 혈액(1010-1012 EVs/mL)2 및 소변(1010 EVs/mL)3과 같은 말초 체액을 순환하는 혈액뇌관문과 같은 해부학적 장벽을 우회할 수 있는 능력으로 인해 EV는 여러 암뿐만 아니라 외상성 뇌 손상10 및 전염병11을 포함한 기타 질병의 진단 및 특성화를 위한 유망한 바이오마커 소스입니다. 또한 EV는 전이성 파종12 및 암의 종양-면역 상호 작용과 같은 생물학적 과정뿐만 아니라 외상성 뇌 손상, 자가면역 질환 및 심장 마비를 포함한 병리학에서 기계적인 역할을 합니다.

현재 EV 연구와 진단 및 치료에 대한 잠재력은 생체 표본의 나노 크기, 복잡성 및 수량의 고유한 조합을 다루도록 설계되지 않은 기술로 인해 방해를 받고 있습니다. 혈액 내 EV의 높은 농도는 특정 EV 하위 모집단을 다른 EV 하위 모집단뿐만 아니라 동일한 크기 범위의 세포 파편과 같은 다른 비 EV 입자(관련 없는 "배경")와 구별하려는 조사자에게 특별한 과제를 제기합니다. . 초원심분리, 상업용 침전 키트(Thermo Fisher, System Biosciences) 및 크기 배제 크로마토그래피와 같은 현재 표준 EV 분리 방법에는 EV 하위 집단을 정확하게 정렬하기 위한 표면 마커 선택성과 처리량이 부족합니다.

마찬가지로, 세포의 표면 마커 분류를 위해 이전에 확립된 방법은 나노 규모 EV를 측정하거나 임상 샘플에서 일반적으로 발견되는 많은 수의 EV를 처리하는 처리량을 달성할 수 없습니다. 예를 들어, 혈액 1mL에서 ~ 1011 EV를 처리하는 것은 처리량이 많은 세포 유동 세포 계측법에는 적합하지 않습니다. 일반적인 나노입자 유세포 분석기는 ~ 1000/초18의 속도로 분류하며, 1mL의 혈액을 분류하는 데 ~ 3년이 소요되는 반면, ~ 60,000/초의 속도로 분류하는 최신 세포내 유세포 분석 시스템조차도19 1mL의 혈액을 분류하는 데 19일이 소요됩니다. 피. 이 문제는 < 800 nm EV에 비해 ~ 10 μm 세포의 표면적이 극적으로 증가하여 세포에 비해 EV에서 표면 단백질의 낮은 절대 발현으로 증폭되어 에 대한 검출 수준 아래의 형광 신호를 생성합니다. 상업용 유세포 분석 시스템20. 이러한 과제에 대응하여 정밀 크기 기반 또는 표면 마커 EV 정렬을 수행하기 위해 EV 크기의 마이크로/나노스케일 피처 크기를 사용하여 여러 미세 유체 접근 방식이 개발되었습니다. 그러나 복잡한 나노제조4,21,22, 낮은 최대 입력 부피23,24, 단일 분자 바이오마커 표적에 대한 의존성 또는 낮은 샘플 처리량21에 대한 요구 사항과 같은 제한 사항으로 인해 미세 유체 크기 또는 표면 마커 EV 정렬의 적용이 방해되었습니다.

107 pores/cm2 for d = 600 nm pores5, > 106 for d = 3 µm pores per Cytiva/Whatman). Lastly, track etching combined with vapor deposition of a bilayer, consisting of a soft magnetic layer of NiFe and a passivation layer of Au, offers inexpensive fabrication of large numbers of precisely-defined magnetic nanopores while bypassing expensive and difficult-to-scale lithography5./p> 10% of the magnetic nanopores become occluded. This feature arises because the fluidic resistance of the magnetic nanopores is several orders of magnitude greater than the resistance between pores, and as such when a pore is occluded the flow is distributed not only to its nearest neighbors, but uniformly over the entire 107 pores as if they are in connected in a parallel circuit27. Moreover, in many applications of isolating specific sub-populations of EVs, the subpopulation is sparse (ex. ~ 1900 tumor-derived EVs/mL per mm3 of tumor volume for highly-shedding tumors)28 in comparison to the total number of EVs. Therefore even in a case when TENPO processes 1011 EVs in a mL of human plasma, several orders of magnitude less targeted EVs are captured on the TENPO’s ~ 107 magnetic nanopores. Because our device sorts EVs one at a time, in a device that is matched in scale to that of nanoscale EVs, it can sort EVs based on quantitative expression of surface markers, akin to flow cytometry for cell based sorting. This is in contrast to conventional methods that use micrometer-scale sized beads or devices29, where EV capture is dictated by a single binding event. Moreover, previous immunoaffinity bead isolation methods have been limited by the requirement that a high proportion of EVs express a given target protein30./p>

2.5 mL/h, Rs decreased as a function of flow rate ɸ. At flow rates ɸ < 2.5 mL/h, 1-Rw increased as a function of ɸ, and beyond ɸ > 2.5 mL/h, all weakly targeted EVs were successfully discarded. (Fig. 2C). This model system demonstrates the potential for tuning the tradeoff between Rs and 1-Rw in this model scenario featuring both targeted EVs and off-target EVs with non-specifically bound MNPs./p> 33)./p> 10 mL/h rather than decreasing (Fig. 3C, SI Fig. 11). This difference may be due to differences in magnetic labeling where EVs with greater than 15 MNPs are still captured at high flow rates. We observed no change in isotype-labeled EV RNA at any of the flow rates, in contrast to the predicted decrease in background on simulation. As in the membrane number scan, we hypothesize that the isotype background Cq values are closer to the limit of detection of our PCR assays. We observed the greatest difference between the antibody-labeled versus isotype-labeled EVs at a flow rate of ɸ = 2.5 mL/h (Fig. 3C, SI Fig. 11)./p> .05), while for GAPDH there was a significant difference between the antibody replicates (p = .014) but not the isotype replicates (p > .05)./p> 1000) of clinical samples are required. By virtue of its low construction/operation cost (cost for one pan-EV prototype TENPO assay = ~ $35; $12 material/fabrication5, $5 antibody, $18 beads) and compatibility with roll-to-roll manufacturing, TENPO could be scaled up to fast chip manufacturing while also having the throughput for large clinical cohorts. The fabrication cost of TENPO is invariant to pore diameter, unlike most microfluidic approaches which rely on lithographic fabrication. Previous work in our group with TENPO using 600 nm pores to isolate EV subpopulations was able to yield clinically-relevant diagnostic information in n = 204 pancreatic cancer samples6 as well as in n = 96 traumatic brain injury samples10. In these cases, TENPO using 600 nm pores was able to distinguish biological nucleic acid signals from background, which can be improved even further with the 10× improvement in specificity versus isotype background suggested in this manuscript./p>

~ 3 × 109 EVs for pancreatic cancer, 1 mL—> ~ 9 × 1010 for lung cancer, 1 mL—> ~ 9 × 108 for liver cancer) into healthy human plasma (0.75 mL healthy human plasma for pancreatic cancer, 0.25 mL healthy human plasma for lung and liver cancer; plasma has an EV concentration of 2 × 1012 EVs/mL as measured via NTA). Equivalent volumes of non-conditioned clean culture media (media not exposed to cancer cells) were added to the volumes of healthy human plasma stated for each cancer media type to make the “healthy” samples./p>